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File name:螯虾造血干细胞培养
Category:Protocols
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Published:2013-11-13 10:32:59
Update:2013-11-14 03:52:22
Summary:

一、试剂

1、磷酸盐缓冲溶液(CPBS)pH 6.8

        10 mM Na2HPO4; 10 mM KH2PO4; 150 mM NaCl; 10 μM CaCl2; 10 μM MnCl2

2、培养基

        L-15 medium (SigmaAldrich) supplemented with 5 μM 2-ME, 1 μ M phenylthiourea, 60  μg/ml penicillin, 50 μ g/ml streptomycin, 50 μg/ml gentamicin (Sigma-Aldrich), and 2 mM L-glutamine.

3、细胞因子

        直接抽取螯虾血液(不加抗凝剂),5000 rpm离心5 min去除血细胞;上清再次20000 rpm离心3-4小时,此上清即为细胞因子。

二、实验步骤

1、沿螯虾头胸甲两侧纵向剪开,将两侧壳去除,再将中间壳块掀开,过程中将粘连的结缔组织用刀小心的挑断,直至露出三角区;

2、用CPBS清洗三角区,用镊子将膜块取出,放于含胶原酶的CPBS中(1 mg/ml)(0.75 ml/只),室温放置消化40-50 min;

3、待膜块消化至薄纱状,5000 rpm离心5 min;

4、弃除上清后,加入1 ml CPBS,吹吸10次,尽量避免气泡,吹大块样;

5、5000 rpm离心5 min,弃除上清;

6、重复步骤4、5一次,加入0.5-1 ml培养基悬浮细胞;

7、吸取细胞悬液(去掉块状沉淀),按105 cell/ml进行细胞铺板;

8、16-25℃放置培养;

9、培养30min后,按每100 μl加入1 μl细胞因子,继续培养;

10、培养过程中每两天更换培养基一次。

参考文献:Lin X, Kim YA, Lee BL, Söderhäll K, Söderhäll I. Identification and properties of a receptor for the invertebrate cytokine astakine, involved in hematopoiesis. Exp Cell Res. 2009, 315(7): 1171-1180.

 

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