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File name:细菌V3区扩增
Category:Protocols
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Published:2013-12-03 08:44:54
Update:2013-12-11 03:43:07
Summary:

一、试剂

1、引物

   341-F(GC):5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’

   534-R: 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’

2、PCR相关试剂同普通PCR

二、实验步骤

(1)以提取的总基因组为模板,利用引物341-F(GC) 和534-R 对16S rRNA V3 区进行扩增;
 
(2)利用rTaq 按照说明配制反应体系,DNA 用量为500-600ng;

          rTaq酶扩增体系及反应条件:

              10×PCR Buffer                      5 μl

              dNTPs(2.5 mM)                    4 μl

              341-F(GC)(20 μM)                1 μl

              534-R(20 μM)                       1 μl

              rTaq                                  0.25 μl

              模板                                   600 ng
 
              ddH2O                        up to 50 μl   

(3)PCR 程序:

          94℃预变性5 min;

          94℃变性1 min,65℃退火1 min,72℃延伸3 min,退火温度在每个循环递减0.5℃,进行20个循环;

          94℃变性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸3 min,进行10个循环;

          72℃延伸10 min。

(4)电泳检测。


 

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