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File name:Denaturing gradient gel eletrophoresis (DGGE)
Category:Protocols
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Published:2013-12-03 08:49:33
Update:2013-12-03 08:49:33
Summary:

一、试剂

1、40%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺母液(37.5:1)

2、TAE (50×):Tris-HAc 2 M,EDTA 50 mM,pH 8.5

3、20%变性浓度的胶溶液:

     40%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺母液     100 ml

     50×TAE                                                 10 ml

     甲酰胺                                                   40 ml

     尿素                                                         42 g
 
     ddH2O                                             至500 ml
 
4、70%变性浓度的胶溶液:

     40%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺母液     100 ml

     50×TAE                                                 10 ml

     甲酰胺                                                  140 ml

     尿素                                                        147 g

     ddH2O                                              至500 ml

5、过硫酸铵溶液(APS): 10% (w/v)

6、TEMED

二、实验步骤

1、DGGE样品制备
 
(1)DGGE样品经PCR扩增后进行电泳检测;

(2)PCR产物纯化后即可用于DGGE电泳上样,上样量视浓度而定。等体积的PCR产物和6×loadingbuffer混合上样。

2、DGGE电泳

(1)选择两块匹配的玻璃板(一大一小),将大玻璃板平放于桌面上,左右边缘各平铺一块垫片(注意垫片成套使用,

           凹口相对位于玻璃板上部),将小玻璃板压于垫片上,用制胶夹板固定玻璃板后使其竖直立于桌面,松开夹板上的

          旋钮调整两块玻璃板的水平位置至底部平齐,使用提供的校正板调整左右垫片是两者平行以及垫片与水平面垂直,

          调整好后拿出校正板将旋钮拧紧。

(2)将软垫片平铺至制胶位,将调整好的制胶板放至制胶位(共有两个制胶位可同时制胶两块),左右手同时操作底部

          白色旋钮,先使有柄端竖直向上左右手同时用力将旋钮插入制胶夹板侧面夹缝中,然后旋转手柄180°将制胶板固定

          在 软垫片上。

(3)用之前配制好的20%和70%变性浓度的胶储液分别配制30%(20%:70%=4:1)、60%(20%:70%=1:4)变性浓度的

          丙烯酰胺溶液各16ml,加入1/200(80 μl) APS及1/2000(8μl) TEMED并立即混匀,将溶液吸入对应的带软管的注

          射器中,排除注射器及软管中的气泡,将注射器固定至变性梯度生成仪上(注意高低浓度固定位置的选择)。

(4)将两个注射器上的软管连接到Y形连接软管上,将Y形连接管的另一端贴于大玻璃板的中部,从胶板中间缓慢匀速轮

          转变性梯度生成仪使丙烯酰胺溶液缓缓注入玻璃夹缝中(注意接口一定要在玻璃板中央且灌注速度不宜过快)。

(5)待溶液全部注入玻璃夹缝后,将匹配的梳子插入玻璃板夹缝的中央,(注意插入梳子时贴着大玻璃片并且动作要轻

          以防产生气泡和丙烯酰胺溶液的溢出),等待丙烯酰胺溶液凝固成胶(一般放置过夜)。在此同时制两块胶以用于

           DGGE电泳时形成密闭的循环泵。

(6)将两块制胶板固定到承载核上放入电泳槽中,注意左右平衡。

(7)往电泳槽中加入缓冲液(1×TAE)至FILL刻度与RUN 刻度之间,承载核上部制胶板之间需加满缓冲液。

(8)加盖温度控制箱,接通加热电源,加热缓冲液(缓冲液低于FILL 刻度时禁止加热!),此时不需开启PUMP 功能,

          温度加热至60℃。

(9)缓冲液达到所需温度时停止加热,拔出电源插头,移开温度控制箱。 使用5mL移液枪反复吹打梳孔,除去孔内沉积

          的尿素,再使用移液枪上样。

(10)加盖温度控制箱继续加热缓冲液至60℃,开启PUMP功能。接通电泳电源开始电泳。

              Step1: 30V/500mA/250W 15 min。

              Step2:130V/500mA/250W 4.5 h。

(11)电泳结束后停止加热及电泳电源,移开温度控制箱,取出承载核卸下制胶板,小心剥离下聚丙烯酰胺凝胶置于EB

          (0.5 μg/ml)溶液中染色15 min,在凝胶成像系统照像。
   
3、DGGE条带回收

(1)DGGE电泳结束后,EB染色,拍照,将菌群条带标记后依次切胶回收,置于1.5 ml离心管。切下的胶块用ddH2O冲洗

          2-3次,然后用钝吸头将胶块捣成碎屑。加入15 μl ddH2O,-80℃反复冻融处理3次,以充分释放胶中的DNA。

(2)以含有目的DNA片段的溶液取3 μl作为模板,按DGGE PCR条件重新做DGGE PCR。

(3)将PCR产物纯化、连接到T载体,转化E. coli,通过菌落PCR挑取有正确大小插入片段的阳性克隆子。

(4)将阳性克隆子送测序。将结果提交NCBI进行网上比对。

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