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File name:CTAB/NaCl法提取微生物基因组
Category:Protocols
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Published:2013-12-11 03:30:31
Update:2013-12-11 03:44:28
Summary:

一、试剂

1、10% (w/v) SDS

      将10g SDS溶于适量纯水中,定容至100ml。

2、5 mol/L NaCl

      将29.2g NaCl溶于适量纯水中,定容至100ml。

3、CTAB/ NaCl溶液(10%CTAB/0.7mol/L NaCl,避光保存)

      在80ml纯水中溶解4.1g NaCl,缓慢加入10g CTAB(避光),同时加热搅拌。如有需要,可加热至65℃溶解,

      定容至100ml。

4、70%乙醇

      将70 ml无水乙醇溶于适量纯水中,定容至100ml。

5、ELB缓冲液

      20 mM Tris-HCl ,pH 8.0 ;2 mM EDTA ;1.2% Triton X-100;Lysozyme 5 mg/ml ;

      另外添加 1/50 0.5 M EDTA 至终浓度为20 mM。

二、实验步骤

1、培养1 ml的微生物至饱和状态,8000 rpm离心5min,弃上清。

2、每份沉淀物中加入567 μl 的ELB缓冲液使之重悬,37℃水浴温育1-2 h。

3、加入30 μl 10%SDS和3 μl 蛋白酶K(20 mg/ml )(用量可适当增加),颠倒混匀,55℃水浴温育3 h。

4、加入100 μl 5mol/L NaCl,充分混匀,再加入80 μl CTAB/NaCl溶液,颠倒混匀,65℃水浴温育10 min。

5、加入5 μl RNaseA(10 mg/ml ),颠倒混匀,37℃水浴温育10-30 min。

6、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),颠倒混匀,13000 rpm 4℃离心10 min,将上清转入新管中;

      如果难以移出上清,可先用无菌牙签去除界面物质,或重复多次此操作至界面澄清。

7、加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混匀,13000 rpm 4℃离心10 min,将上清转入新管中。

8、加入2倍体积-20℃预冷无水乙醇和 1/10 体积 3 mol/L KAc溶液(pH 8.0),轻轻混匀,-20℃放置2 h以上

      至DNA沉淀下来,13000 rpm 4℃离心20 min,弃上清。(或用0.6倍体积的异丙醇沉淀)

9、向沉淀中加入1 ml 70%乙醇中洗涤2次,13000 rpm 4℃离心5 min,弃上清。

10、沉淀挥发残留乙醇3-5 min,稍加风干,溶于适量ddH2O中。

11、测定基因组DNA溶液浓度和纯度,取100-200 ng左右DNA 1%琼脂糖胶电泳。

参考文献:《精编分子生物学实验指南》

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